蛋白质立体结构(protein structure)的解析–

作者: 时间:2020-08-03W生活港667人已围观

蛋白质立体结构(protein structure)的解析–

蛋白质结构:依序为一级到四级结构

分析蛋白质立体结构的程序大致如下,先以基因转殖的大肠桿菌大量生产标的蛋白质,其方法为利用分子选殖技术将研究标的基因DNA,置入大肠桿菌的表现载体,之后利用转型技术将表现载体转入大肠桿菌中,表现的蛋白质其胺基酸序列可由DNA可以推导出,接下来进行一系列蛋白质的纯化步骤,取得高纯度的蛋白质后,运用化学试剂将水溶性的蛋白质,转换成蛋白质晶体,在X光绕射法下,将所得数据经由一系列的数学运算,转换得其三维立体结构。

为了得到菌体内未变性(即未丧失三级结构和活性)的蛋白质,将基因转殖菌体加入机器中的容器内,再以高压破菌器Fresh Press将容器内的基因转殖菌体,快速通过容器的小孔出口(其口径小于大肠桿菌),如此即可将具有细胞壁的大肠桿菌,压破释放出菌体内的各种蛋白。

利用快速液相色谱仪(FPLC)搭配不同性质和特性的纯化蛋白质用的管柱,依照研究标的蛋白质的特性,可以从已破菌的菌液中分离出标的蛋白质。纯化蛋白质用的管柱,可以分为:(1)亲和性管柱:经典代表为镍金属的树脂,当将研究标的在其蛋白质的头或尾端,加上6个His(可与镊金属结合形成敖合物),之后在利用与His类似的化合物,与和镍金属结合的蛋白质竞争,进而分离出带6个His的研究标的蛋白质;(2)分子筛管柱: 可以依照分子量大小不同,导致流出管柱的时间点不同来分离;(3)离子交换树脂管柱:利用蛋白质在不同pH值下,会使蛋白质改变其本身的电荷,来达到吸附管柱的效果,将研究标的蛋白质与其他大肠桿菌本身所携带的蛋白质分离。

利用UV光OD280(波长280nm)可侦测蛋白质的特性,可以将从管柱流出的蛋白质绘出吸收峰图型,在对照收集圆盘内所纯化蛋白质的收集试管,搭配蛋白质电泳SDS-PAGE观测,取试管内的液体进行蛋白质电泳,可以更加确定蛋白质的分子量及纯度。

在确认试管内蛋白质为研究标的蛋白质后,接下来就是近一步确定研究标的蛋白质的纯度是否达到水準,基本上须达到95%以上的纯度,之后接着进行蛋白质浓缩的工作,因为需要将蛋白质浓缩到快接近过饱和的状况,才有机会长出晶体,在蛋白质结晶方面,藉由配製出适合该种蛋白质的介质,使该蛋白质达到饱合浓度,进而析出长出晶体,这时需借助生技公司开法的片盘.,每个片盘上有96个孔洞,孔洞内则有不同条件的介质以利蛋白质的析出与长晶。通常需试上1000种以上的条件才可找出最接近一种蛋白质析出或长晶的介质,此过程称为结晶条件之随机筛检(random scan)。接着以此种介质为条件,人工配置微调介质成份的自製介质,再将此一蛋白质放入新片盘,藉以得到一种蛋白质析出或沉澱的最佳浓度或成份比例,可将蛋白质置于光学显微镜下观察其结晶形状,确认最佳蛋白质析出或沉澱之介质。

参考文献:
维基百科-蛋白质结构

相关文章